Topmusicanswers
PCR ir RT-PCR stiprinimo trikčių šalinimas
| Problema | Galima priežastis |
|---|---|
| Nėra juostų ant gelio | Pratęsimo laikas buvo per trumpas |
| Terminio ciklo temperatūra buvo netinkama | |
| Papildomos, nespecifinės juostos ant gelio | Gruntai hibridizavosi į antrinę šablono vietą |
| DNR užterštumas buvo įvestas į pradmenis ar buferius |
- Kas sukelia PGR gedimą?
- Kaip pašalinti PGR problemą?
- Ką darytumėte, jei PGR amplifikacija nepavyko?
- Kas atsitinka, kai į PGR pridedama per daug pradmenų?
Kas sukelia PGR gedimą?
Paprastai pirmas dalykas, kurį mokslininkai daro, yra kaltas dėl sugedusio fermento ar reagento, kai eksperimentas nepavyksta, tačiau naudojant PGR tai iš tikrųjų yra mažesnė nesėkmės priežastis. Dažniau priežastis yra gilesnės vidinės problemos, tokios kaip grunto dizainas, termociklerio parametrai ar nespecifinis susiejimas su kitomis šablonų sekomis.
Kaip pašalinti PGR problemą?
Patikrinkite pasirinktų DNR polimerazių amplifikacijos ilgio galimybes. Naudokite DNR polimerazes, specialiai sukurtas ilgam PGR. Pasirinkite didelio našumo DNR polimerazes, kurios gali sustiprinti ilgus taikinius per trumpesnį laiką. Sumažinkite atkaitinimo ir prailginimo temperatūrą, kad padėtumėte rišti gruntą ir fermentų termostabilumą.
Ką darytumėte, jei PGR amplifikacija nepavyko?
Jei amplifikacijos reakcija nepavyksta ir įtariate, kad DNR šablonas yra užterštas inhibitoriumi, pridėkite įtariamą DNR preparatą prie kontrolinės reakcijos su praeityje gerai sustiprėjusiu DNR šablonu ir pradmenų pora .
Kas atsitinka, kai į PGR pridedama per daug pradmenų?
Didesnės koncentracijos pradmenų naudojimas gali turėti tokį poveikį: Jei pradmenys gali sudaryti dimerus, padidinus jų koncentraciją, susidaro tik pradmenų dimeriai ir nepagerėja norimo PGR produkto amplifikacija.
