Per daug šablono pcr

Bendras DNR kiekis PGR turi ryškų poveikį PGR procedūros rezultatams. Naudojant per daug bendros DNR, DNR supakuojama uždaroje reakcijos indo erdvėje ir gali atsirasti klaidingas pradžia ir net prasta DNR sintezė dėl trukdančios didelių Taq polimerazės molekulių difuzijos.

1. Kiek šablono turėčiau pridėti prie PGR??
2. Ar per daug pradmenų gali slopinti PGR?
3. Kas gali sukelti PCR reakcijos nesėkmę?
4. Kiek DNR pakanka PGR?

Kiek šablono turėčiau pridėti prie PGR??

Nors teoriškai pakaktų vienos šablono molekulės, klasikiniam PGR paprastai naudojamas žymiai didesnis DNR kiekis, pavyzdžiui, iki 1 µg genominės žinduolių DNR ir tik 1 pg plazmidės DNR (1).

Ar per daug pradmenų gali slopinti PGR?

Teršalai dNTP mišinyje gali sukelti nepilną ar neteisingą amplifikaciją arba PGR slopinimą. Naudokite aukštos kokybės dNTP. Naudojant per didelę pradmenų koncentraciją, gali padidėti tikimybė, kad pradmenys nespecifiškai prisijungs prie nepageidaujamų šablono vietų arba tarpusavyje.

Kas gali sukelti PCR reakcijos nesėkmę?

Pamiršus tik vieną PGR reakcijos komponentą, nesvarbu, ar tai būtų DNR polimerazė, pradmenys ar net šablono DNR, reakcija bus nesėkminga. Paprasčiausias sprendimas yra pakartoti reakciją. ... Jei po to vis dar nėra PGR produkto, yra tikimybė, kad jūsų reakcijai trukdo dar kažkas.

Kiek DNR pakanka PGR?

Įprastoje 50 µL reakcijoje tikslinės DNR amplifikacijai pakanka 1-2 DNR polimerazės vienetų. Tačiau gali prireikti koreguoti fermentų kiekį naudojant sudėtingus šablonus. Pavyzdžiui, kai DNR mėginyje yra inhibitorių, padidinus DNR polimerazės kiekį, gali pagerėti PGR išeiga.